一. 背景簡(jiǎn)介
永生化 是一種細胞生物學(xué)術(shù)語(yǔ)。是指動(dòng)物細胞脫分化失敗，受到病毒感染，外源惡意代碼轉染，輻射或藥劑作用后，細胞分裂次數限制機制和DNA檢查-自毀機制失靈，導致細胞具有無(wú)限分裂生長(cháng)的能力的過(guò)程成為細胞永生化。
（永生化原理圖）
二.不同的細胞永生化方法
HPV 可介導人的包皮細胞、角化上皮以及乳腺、胰導管和口腔等的上皮細胞永生化；
猿猴病毒的SV40大T抗原 (TAg)用于黏附細胞、成纖維細胞、內皮細胞等；
EBV 用于淋巴母細胞樣細胞；
端粒酶TERT 用于間充質(zhì)干細胞和其他一些細胞。
三.案例解析
赫特維希上皮根鞘(HERS)原代細胞永生化解決方案
Li et al. Stem Cell Research & Therapy(2019) 10:3
赫特維希上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath, HERS)細胞是一群在牙根發(fā)育以及牙周組織形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用的特殊細胞。在牙根發(fā)育過(guò)程中，HERS通過(guò)上皮-間充質(zhì)轉化（EMT）向成牙骨質(zhì)細胞分化，并通過(guò)上皮-間充質(zhì)相互作用（EMI）誘導牙乳頭向成牙本質(zhì)細胞分化，在引導牙根形成中發(fā)揮重要作用。
實(shí)驗動(dòng)物：PN8大鼠
組織：第一下頜磨牙
分離原代細胞：解剖PN 8時(shí)下頜第一磨牙根尖區的Hertwig上皮根鞘，用2.4 U/mL分散酶和625 U/mL膠原酶解離組織（圖a）
培養條件：由基礎培養基、2%胎牛血清、1%上皮細胞生長(cháng)添加劑和1%青霉素/鏈霉素溶液組成
生長(cháng)特性：貼壁，呈典型的鵝卵石樣外觀(guān)（圖b）
吉滿(mǎn)生物助力工具病毒
pGMLV-SV40T-PURO慢病毒
構建永生化流程
01用編碼猿猴病毒40大T抗原(SV 40 LT)和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒載體(pGMLV-SV 40 T-PURO,Genomeditech,Shanghai,China)轉染第1代純化的原代HERS細胞
02轉染后，通過(guò)向培養基中補充2 μg/ml嘌呤霉素篩選細胞
03使用有限稀釋法，將細胞分離為單細胞，并培養擴增所選克隆
04通過(guò)克隆形成細胞的篩選，共篩選出68個(gè)克隆，這些克隆可培養50代以上
永生化細胞特性與鑒定
其中，兩個(gè)細胞系命名為HERS-H1和HERS-C2，呈鵝卵石樣形態(tài)（圖d），是貼壁的，具有高增殖能力，倍增時(shí)間約為24小時(shí)（圖e）；
HERS細胞標志物：細胞角蛋白14（CK14）、上皮鈣粘蛋白（E-cadherin）和間充質(zhì)波形蛋白（vimentin）均呈陽(yáng)性表達，提示細胞同時(shí)具有上皮細胞和間充質(zhì)細胞的特征，且HERS細胞標志物的表達維持至少20代（圖f）。
產(chǎn)品清單
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